規(guī)范性引用文件：

《GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法》、《HJ 494 水質(zhì) 采樣技術(shù)指導(dǎo)》、《HJ/T 91 地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》。

方法原理

滅菌處置后的廢水通過孔徑為 0.45 μm 的濾膜過濾，細(xì)菌和芽孢被截留在濾膜上，然后將濾膜置于酪氨酸選擇性培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng) 72 h～96 h，枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生的酪氨酸酶可分解利用酪氨酸形成黑色素，產(chǎn)生黑色的特征菌落。對特征菌落進(jìn)行染色鏡檢和生化試驗做進(jìn)一步鑒定，枯草芽孢桿菌黑色變種為革蘭氏陽性芽孢桿菌，營養(yǎng)細(xì)胞呈桿狀，單個或呈短鏈狀排列，芽孢橢圓形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，還原硝酸鹽，水解淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。根據(jù)結(jié)果報告檢出或未檢出枯草芽孢桿菌黑色變種。

儀器和設(shè)備

采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的 500 ml 廣口玻璃瓶。

恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差 36℃±1℃。

高壓蒸汽滅菌器：121℃可調(diào)。

pH 計：準(zhǔn)確到 0.1pH 單位，或更高精度。也可使用 pH 比色管或 pH 精密試紙。

顯微鏡：物鏡 10×倍、20×倍、40×倍，油鏡 100×倍，目鏡 10×倍或 15×倍。

分析天平：感量 0.0001 g。培養(yǎng)皿：直徑 90 mm。

過濾裝置：配有砂芯濾器和真空泵，抽濾壓力勿超過-50kPa。

接種環(huán)、鑷子。

移液管：1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可使用計量合格的可調(diào)式移液器。

量筒：100 ml。三角瓶：100 ml。酒精燈。

無菌操作設(shè)備：無菌室或超凈工作臺、生物安全柜。

注：移液管、采樣瓶、培養(yǎng)皿、三角瓶等玻璃器皿試驗前要按無菌操作要求包扎，高壓蒸汽滅菌器（7.3）121℃滅菌 20 min，烘干，備用。

樣品采集

點(diǎn)位布設(shè)及采樣頻次按照 HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

采集微生物樣品時，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。

如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液（6.13），以除去活性氯對細(xì)菌的抑制作用（每 125 ml 容積加入 0.1 ml 的硫代硫酸鈉溶液）；如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.14），以消除干擾（每 125 ml 容積加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。

注：15.7 mg 硫代硫酸鈉（6.11）可去除樣品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據(jù)樣品實際活性氯量調(diào)整。

培養(yǎng)

用滅菌鑷子夾取濾膜移放在酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基（6.1）上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后用石蠟質(zhì)封口膜（6.17）封好培養(yǎng)皿，倒置培養(yǎng)皿，放入恒溫培養(yǎng)箱（7.2）內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng) 72 h～96 h。培養(yǎng) 96 h 后，如培養(yǎng)基上未有菌落生長，則試驗終止；如培養(yǎng)基上有菌落生長，則挑取黑色的特征菌落于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（6.2）上，36℃±1℃培養(yǎng) 24 h，待鑒定。同時將已挑菌落的酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿儲存于 2℃～5℃，以備必要時復(fù)查。

注：菌落顏色無法判斷時，可再次劃線接種至酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基（6.1）培養(yǎng)后觀察；若菌落為灰色或灰黑色，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間后觀察，培養(yǎng)時間不超過 7d。

染色鏡檢

挑取可疑菌落（9.3），分別使用革蘭氏染色液（6.9）和芽孢染色液（6.10）染色，具體操作及結(jié)果觀察詳見附錄 B，若使用市售商品化試劑，則按說明書操作，然后鏡檢。左——革蘭氏染色；右——芽孢染色。圖 2 枯草芽孢桿菌黑色變種染色鏡檢圖

生化試驗

挑取特征菌落（9.3），分別接種到淀粉培養(yǎng)基（6.3）、硝酸鹽培養(yǎng)基（6.4）、甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基（6.5）、甘露糖生化培養(yǎng)基（6.6）、甘露醇生化培養(yǎng)基（6.7）和苦杏仁苷生化培養(yǎng)基（6.8）上，具體操作及結(jié)果觀察詳見附錄 B，若使用市售商品化培養(yǎng)基，則按說明書操作。